T/CI 160—2022 极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技术指南-团体标准

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标准详细信息
标准状态  现行
标准编号  T/CI 160—2022
中文标题  极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技术指南
英文标题  Technical guidelines for isolation, culture, preservation and application of extreme environmental fungi
国际标准分类号  07.100.01 微生物学综合
中国标准分类号  B04
国民经济分类  C276 生物药品制品制造
发布日期  2022年12月15日
实施日期  2022年12月15日
起草人  张世宏、魏 毅、于术军、刘庆玉、李凤兰、李桂华、耿丽娟、李柱刚、林汉明。
起草单位  沈阳农业大学、辽宁伊品九利农业科技发展有限公司、沈阳汉明种业有限公司、东北农业大学、吉林大学、沈阳市食品药品检验所、沈阳九利肥业股份有限公司、黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所、香港中文大学。
范围  本文件提供了极端环境真菌（以下简称“极端真菌”）的来源，分离、培养、鉴定、保藏方法和生物技术应用指南。 本文件适用于极端真菌的分离、培养、鉴定、保藏与应用。
主要技术内容  极端环境真菌 extreme environmental fungi
在常见普通真菌无法生存的极端环境条件下（如高温低温、高盐、高毒素、缺水、脱水、低氧厌氧、高低压强等）能够正常生长、发育、繁殖的真菌。
注：　常见的普通真菌一般生长在温度22℃～36℃，湿度95％～100％，pH5～6.5的有氧环境。普通真菌对高/低温度、高渗透（高盐与脱水）、高毒素、低氧或厌氧、高低压强等敏感、适应性差。
3.2　
嗜冷真菌 psychrophilic fungi      
最适生长温度小于等于15℃、最高生长温度小于等于25℃的真菌。
3.3　
嗜热真菌 thermophilic fungi
最适生长温度大于等于40℃、最低生长温度大于等于20℃的真菌。
3.4　
嗜盐真菌 halophilic fungi
在大于等于5%钠、钾等常规盐离子浓度环境生长最快的真菌。
3.5　
毒素降解真菌 toxin-degrading fungi
适宜于在毒素环境生存，具有将呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素（AFT）、玉米赤霉烯酮（ZEN）等毒素降解为低毒或者无毒物质的真菌。
3.6　
钝化重金属真菌 passivate heavy metal fungi
适宜于在重金属污染环境生存，具有钝化重金属，使其缓慢氧化或化合，减少离子状态，从而缓解作物吸收的真菌。
3.7　
重金属 heave metal
密度大于4.5g/cm3的金属。
注：　在环境污染方面，重金属主要是指汞（水银）、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重元素。重金属非常难以被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体。重金属在人体内能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒。2018年我国颁布的《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）GB 15618-2018》和《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准（试行）GB 36600-2018》规定了土壤环境重金属污染上限指标，超过此指标即存在影响人类健康的危害，需要及时的修复和风控。砷在第一类土地中不能超过120 mg/kg,第二类土地中不能超过140 mg/kg。镉在第一类土地中不能超过47 mg/kg，在第二类土地中不能超过172 mg/kg。铬在第一类土地中不能超过30 mg/kg，在第二类土地中不能超过78 mg/kg。铅在第一类土地中不能超过800 mg/kg，在第二类土地中不能超过2500 mg/kg。汞在第一类土地中不能超过33 mg/kg，在第二类土地中不能超过82 mg/kg。
5　试剂和材料
5.1　除另有规定外，试剂为分析纯和蒸馏水。
5.2　DNA胶回收试剂盒、各种毒素ELISA检测试剂盒、毒素荧光定量快速检测试纸条。
5.3　2xTaq PCR StarMix ：pcr预混液。
5.4　极端真菌鉴定引物对ITS1和ITS4。
5.5　50×TAE电泳缓冲液：称取242.0g Tris-base、37.2g EDTA-Na2·2H2O、57.1mL冰醋酸，溶解于适量蒸馏水中，用10M NaOH溶液调节pH=8.3，补充水分定容至1000mL，室温保存。使用时需将50×TAE稀释为1×TAE。
5.6　30%无菌甘油：水：甘油=7:3，121 ℃灭菌15min。
5.7　CTAB溶液：称取20g CTAB、29.2g EDTA-Na2·2H2O 、1M Tris-HCl 100mL(pH=8.0)、5M NaCl 280mL，溶解于适量蒸馏水中，补充水分定容至1000mL，1%的β-巯基乙醇（现用现配），室温保存。
5.8　氯仿异戊醇混合液：氯仿：异戊醇体积比为24:1，在通风橱中，将异戊醇加入到氯仿中混合均匀即可。
5.9　10M NaOH溶液：称取400g NaOH，溶解于适量蒸馏水中，补充水分定容至1000mL，配制成10M的NaOH溶液。
5.10　PBS磷酸盐缓冲液：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4 和0.24g KH2PO4，溶解于适量蒸馏水中。用盐酸调节pH=7.4，补充水分定容到1000mL，用0.22um的微孔滤膜抽滤灭菌。4℃保存。
5.11　琼脂糖凝胶：称取10g琼脂糖，缓慢加入1×TAE缓冲液，加热使之充分溶解，配制成10g/L的琼脂糖凝胶。
5.12　PDA培养基，按以下步骤制备： 
a)　称取200g去皮马铃薯，切成小块，加适量水煮沸20min~30min（能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤；
b)　在过滤液加入18g琼脂粉，继续加热搅拌混匀，待琼脂粉溶解完后，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装玻璃试管或者锥形瓶，用封口膜封口，121℃灭菌15min。液体培养基PDB不加琼脂粉；
c)　PDA斜面培养基：分装量为玻璃试管高度的1/4（4mL ~5mL），灭菌后趁热摆放斜面，制成斜面培养基，倾斜度为试管中的培养基约占试管长度的1/2。
5.13　降解DON筛选培养基：称取1g（NH4）2SO4、3 g KH2PO4、6g K2HPO4、0.5g NaCl、0.5g MgSO4·7H2O、0.05g CaCl2、0.001g FeSO4·7H2O、0.05g蛋白胨、20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节pH=6.0~7.0，补充水分定容至1000mL， 121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入抽滤除菌的氧化苯乙烯，终浓度为15mmol/L，趁热倒入培养皿, 待培养基凝固即制成脱氧雪腐镰刀菌烯醇筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。
注：　氧化苯乙烯是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）类似物，可替代DON进行初步筛选高效降解DON毒素真菌。
5.14　降解AFT筛选培养基：称取5.0g（NH4）2SO4、2.5 g KH2PO4、1.0g MgSO4、0.5g Na2HPO4·12H2O、0.1g CaCl2、20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节pH=6.5，补充水分定容至1000mL， 121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入抽滤除菌的香豆素溶液，终浓度为1g/L，趁热倒入培养皿, 待培养基凝固即制成黄曲霉毒素筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。
注：　香豆素是黄曲霉毒素（AFT）类似物，可替代AFT进行初步筛选高效降解AFT毒素真菌。
5.15　降解ZEN筛选培养基：称取2.0g (NH4)2SO4、0.5g NaH2PO4、0.5g K2HPO4、0.2g MgSO4、0.1g CaCl2、20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节pH=7.0，补充水分定容至1000mL， 121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入抽滤除菌的赤霉烯酮溶液，终浓度为1g/L，趁热倒入培养皿, 待培养基凝固即制成玉米赤霉烯酮毒素筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。
5.16　含有重金属的PDA培养基制备：PDA培养基配方同5.12，调节pH=5.0 (防止重金属沉淀), 121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入过滤除菌的重金属溶液，趁热倒入培养皿, 待培养基凝固即制成重金属PDA培养基，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。
5.17　含有NaCl的PDA培养基：PDA培养基配方同5.12，pH值自然，加入NaCl制成不同质量分数（%）的NaCl PDA培养基。液体培养基不加琼脂粉。
5.18　琼脂粉培养基：称取琼脂粉18g，溶解于适量蒸馏水中，补充水分定容至1000mL，121℃灭菌15min。
5.19　培养基的无菌检测：将灭菌后的培养基放在28℃~34℃培养箱中，培养1~3天，检查合格后将其保存于4℃或者室温。
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团体详细信息
团体名称中国国际科技促进会
登记证号51100000500017650Q发证机关中华人民共和国民政部
业务范围技术开发 信息交流 专业展览 业务培训 咨询服务
法定代表人/负责人许军
依托单位名称
通讯地址北京市海淀区中关村东路89号恒兴大厦13F邮编 : 100190

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