T/CQAAS 006—2023 花椒品种分子身份证构建方法-团体标准
目录
| 标准详细信息 | |
|---|---|
| 标准状态 | 现行 |
| 标准编号 | T/CQAAS 006—2023 |
| 中文标题 | 花椒品种分子身份证构建方法 |
| 英文标题 | |
| 国际标准分类号 | 01.020 |
| 中国标准分类号 | |
| 国民经济分类 | A019 其他农业 |
| 发布日期 | 2023年12月07日 |
| 实施日期 | 2024年01月01日 |
| 起草人 | 张义刚、程玥啨、谢永红、曾维友、范烨、苏家奎、池浩、周於强、童建川、陈秀强、赵海忠、杨仕春、刘瑜涵、李剑 |
| 起草单位 | 重庆市农业科学院果树研究所、重庆市江津区农产品质量安全中心、重庆市江津区花椒产业协会、重庆市江津区花椒加工业协会、重庆市江津先锋花椒城有限公司、重庆蓓廷农业科技有限公司 |
| 范围 | |
| 主要技术内容 | 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 标准样品 经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，本标准中为农作物种子，即农作物的种植材料或者繁殖材料，包括籽粒、果实和根、茎、苗、芽、叶等。 3.2 分子标记 指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性 DNA 片段。 3.3 SSR 标记 是一类由几个核苷酸（一般为 1～6 个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，由于基本单元重复次数的不同，形成了 SSR 长度的多态性。 3.4 DNA 指纹 具有完全个体特异的DNA多态性，本标准中指 SSR 等分子标记扩增的多态性。 3.5 品种身份证 指反映品种的商品属性和 DNA 指纹信息的数字和（或）字母组合。 4 方法 4.1 DNA提取 采用改良的CTAB法提取花椒新鲜叶片的DNA，具体包括以下步骤： (1)在65℃水浴中预热提前配置好的2×CTAB提取缓冲液，0 .1MTris-HCl、0.02M EDTA、 1 .4M NaCl、2％PVP、2％CTAB； (2)在液氮中研磨石榴叶片至粉末状，转至2.0mL离心管中； (3)迅速加入2×CTAB提取缓冲液1 .0mL，10μlβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴60min，隔10- 15min颠倒摇匀一次； (4)常温下12000rpm离心5min，吸上清转移至新的2.0mL离心管中； (5)加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀5min，放置5min，12000rpm常温离心10min； (6)吸上清到新的2.0mL离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次； (7)离心，吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA； (8)10000rpm常温离心10min； (9)倒掉异丙醇，用500μL乙醇洗沉淀两次，吹干后用100μLTE溶解DNA； (10)加入10mg/mlRNaseA 2μL终浓度200ng/ul混匀，37℃保温2h以上； (11)加入500μLTE，再加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒摇匀2min； (12)12000rpm常温离心10min； (13)吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA； (14)12000rpm常温离心10min； (15)倒掉异丙醇，用500μL乙醇清洗沉淀两次，吹干后用50μLTE溶解DNA；4℃冰箱中保存。 (16)使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。 4.2 花椒叶片的转录组分析 从花椒种质资源中选择20个花椒品种或品系，提取叶片总RNA，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行无参转录组测定，并在该公司在线分析平台美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com/)分析转录组数据。 4.3 分子标记引物的设计 根据20个花椒叶片转录组数据分析结果，设计SSR引物和Indel引物。由于SRAP引物为通用引物，因此根据以往的文献报道，设计SRAP上下游引物。 4.4 SRAP标记扩增 SRAP标记扩增体系是：样品基因组DNA 1.0μL，2XTaq酶 10.0μL，正反引物各 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL；SRAP引物PCR扩增的程序:94 ℃ 预变性 4 min;94 ℃ 变性 45 s,35 ℃复性 1 min,72 ℃ 延伸 2 min,循环 5 次;再 94 ℃ 变性 45 s,50 ℃ 退火 1 min,72 ℃ 延伸 2 min,循环 35次;最后 72 ℃ 延伸 7 min。 4.5 电泳检测 96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，PCR产物1 .0μl，其中该分子量内标和甲酰胺混合液两者的体积比为0.5：8.5；将PCR产物稀释40倍，在96孔板的各孔中分别加入8.5μl去离子甲酰胺、0.5μl LIZ-500分子量内标和1μl稀释后的PCR产物，95℃变性3min，于4℃放置10min，4000转min-1离心1min，于ABI3730 DNA分析仪上进行毛细管电泳；预电泳15kV，3min；2kV电进样10s；电泳15kV，20min。 4.6 数据分析 用Data Collection软件收集原始数据，用Genemapper软件分析收集的原始数据，比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ-500分子量内标，获得SSR扩增片段的精确分子量bp；将花椒品种的DNA指纹信息编码，再结合品种的形态学特征特性及可能具有的特异基因信息，构建花椒资源品种的分子身份证，并利用在线条码生成器http://barcode .tecit .combarcodege .nerator .aspx？LANG＝zhcn和二维码生成软件Encoder2以条码表述构建的花椒品种身份证。 |
| 是否包含专利信息 | 否 |
| 标准文本 | 查看 |
| 团体详细信息 | |||
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| 团体名称 | 重庆市农学会 | ||
| 登记证号 | 51500000450417997P | 发证机关 | 重庆市民政局 |
| 业务范围 | 学术交流、咨询服务、培训人员 | ||
| 法定代表人/负责人 | 许明陆 | ||
| 依托单位名称 | |||
| 通讯地址 | 重庆市九龙坡区白市驿镇高峰寺村（农科大道重庆市农业科学院科研综合大楼2-13房间） | 邮编 : 401329 | |